草履虫（洄水）的培养
草履虫是原生动物的重要代表，也是初学动物学最先接触的动物。以草履虫为代表的纤毛虫在水质净化及监测上有着十分重要的价值。本实验主要是介绍草履虫的纯化和多种培养方法，并通过观察，掌握原生动物的基本特征，进而更好地理解有关原生动物的其他知识。
一、实验准备
（一）材料
干稻草、旧稻草垫子、干玉米雄花穗、干荷叶、小麦粒、离芭叶、干酵母、动物内脏（肝、胰、甲状腺等）、蛋黄、牛肉汁（50g牛肉、 100 g水，煮熟）。
（二）用品
显微镜、放大镜、电炉、恒温培养箱、载玻片、盖玻片、滴管、微吸管、解剖针、烧杯、培养皿、凹玻璃片、纱布、吸水纸、大头针、琼胶、质量分数为3％的甲基纤维素溶液、碘液、葡萄糖、氯化钠、质量分数为１％的洋红溶液、质量分数为0．1％的中性红溶液。
（三）采集和培养
1．采集
选取多处进行采集。凡是有机物含量丰富的污水，均可采250～500 mL水样，当场用放大镜检查。水样镜检，凡呈乳白色，个体较大，圆柱状，一端稍圆一端稍尖的动物，就是草履虫。如果多次检查均未发现草履虫，水样可弃之，另选别处采集。水样取回，经显微镜检查，凡含有草履虫的水样，要在离水样瓶１０～２０cm处，放置一盏灯，经以２４ h照明，使草履虫向水的上层聚集。
2．培养液制备
制备方法较多，可根据教学实际进行选用。
（1）稻草培养液 干稻草10g，剪成3Cm长，放人烧杯，加水1000 m1，煮沸10～15 min，放凉，补足失去水分。在１000 mL水面处划一刻度线，便于日后失水再补。
（2）玉米雄花穗培养液 干玉米雄花穗15 g，剪成3Cm长，加水１000 m1，煮沸10～15 min。
（3）荷叶培养液 干荷叶50 g，适当撕碎，加水１000 mL，煮沸15～20 min。
（4）麦粒培养液 小麦粒１００颗，加水１０００ mL，煮沸10～15 min。
（5）离芭、稻草混合培养液 离芭叶25 g，加水500 m1，煮沸5 min，补足失去的水分后，再加稻草培养液500 m1。
（6）干酵母培养液 市售干酵母0．59，加水1000 mL，摇荡均匀后备用。
（7）脏器培养液 动物内脏5g，剪碎，加水1000 m1，浸泡1 d，滤去内脏与残渣，留下纯净培养液。
（8）蛋黄培养液 煮熟鸡蛋黄2g，加水1000 m1，搅拌均匀。
（9）稻草垫培养液 旧稻草垫，取其10 g，剪成3cm长，加水1000 mL，再加50g葡萄糖。
以上方法中，第1～8种，无论培养液煮沸与否均要放进恒温箱，在25～300C下培养1～2 d，目的是促使培养液长出细菌，以便接种草履虫后，供草履虫索饵。而第9种方法，既不需煮沸培养液，又不需接种草履虫，直接将培养液放进恒温箱培养，只要稻草上附有草履虫包囊，当包囊处于适宜条件时，草履虫就会破囊而出，进行旺盛的代谢活动，在5～7 d内大量繁殖起来。
3．培养 下面介绍三种培养方法。
（1）采集的水样经一昼夜照光，从水面下1Cm处，在瓶壁上已经形成一圈“白线”的地方，用微吸管取液。滴一滴到载片上，经镜检证实水滴中只含草履虫，无任何其他微型生物时，就可用一个新的干净滴管吸培养液，将载片上的草履虫吹人培养瓶中，放置在25～300C环境中继续培养5～7 d，草履虫就会大量繁殖起来。
（2）如果水样中混有少量其他微型生物，可以在载片上先滴一滴牛肉汁，再滴一滴含有草履虫的水样，两滴间距2cm左右，用解剖针从肉汁一端引一条线到含有草履虫的水滴上。两滴连结后，用放大镜仔细观察，会发现草履虫对牛肉汁敏感性很强，草履虫游到牛肉汁滴的速度也快。然后迅速将载玻片放置在显微镜下检查，在确认牛肉汁滴内尤其他微型生物时，迅速用吸水纸切断连结线，用纱布擦干另一侧的水滴，用于净滴管把含草履虫的牛肉汁吹人培养瓶中。如此重复操作几次，然后将培养瓶放在25～300C温度下继续培养，5～7bd后就会有大量草履虫繁殖出来。
（3）如果水样中混杂微型生物的种类与数量过多，不易排除，就需要采用逐步扩大法。一般是从水样中取液，在凹玻片内滴上1～2滴，放置在显微镜下，边观察边用微吸管吸走其他微型生物。当凹坑水中无任何其他微型生物而只含草履虫时，往凹坑放少许培养液，在25～300C下培养，每日补加１／３～２／３培养液。如果几天后，草履虫数量有所增加，就将其转入表面皿或培养皿，继续扩大培养。如果再过几天后草履虫纯化培养效果理想，数量又有所增加，就要再转入大容器培养液继续培养，一直到大容器培养液出现云雾状群落，镜检全是草履虫时为止。
这里特别需要指出的是，草履虫的培养有可能失败。究其原因很多，其中有两点是主要的：其一，可能是接种草履虫的数量过少，个体质量又较差，它们进入新环境后，遇有不适，很快死去，未能传宗接代；其二，可能是稻草之类的材料发霉或残留农药过多，接种后的草履虫中毒死亡，不能繁殖。因此，一旦发现培养液混浊、有特异臭味，镜检无草履虫，就要弃之。为避免由于培养失败贻误教学工作，应多做几瓶培养液，多选用几种培养方法。
4．保种
下面介绍三种保种方法。
（1）培养和观察草履虫的实验一结束，可将培养液集中在一起，放置在环境适宜处，时常滴上1～2滴牛奶（或豆浆），再补足失水量。这些水样就是培养新的草履虫的材料，使用起来十分方便。
（2）也可以将实验所剩培养液，注入几支试管里，按1：4比例，注入新的麦粒浸出液，管口用脱脂棉封住，然后将试管捆在一起，外裹纱布，竖放在容器内，就可长期保存。
（3）也可以在所剩培养液的容器上，加盖一张较厚的洁净的纸，天长日久，培养液会逐渐干涸，只剩干稻草。实验前，只要向容器里加注凉开水，搅拌一下，浸渍ld。用这种浸渍液作接种材料，放人预制的新培养液里，在25～300C的环境中培养，3～5 d后就会有新的草履虫出现。
二、观察草履虫的方法步骤
（一）草履虫对刺激的反应
取一滴清水，滴到干净载片上。在清水滴旁边滴一滴含草履虫的培养液，在培养液远离清水滴的边缘放一小条棉纤维，再在棉纤维未端放一点食盐，然后用解剖针迅速从清水滴一侧向培养液水滴划去，将两者连通起来。这时逐步溶解的氯化钠沿着棉纤维桥梁缓缓进入培养液滴中，草履虫由于受到氯化钠的刺激，立即产生强烈的回避反应，一个个向清水滴游去。
（二）草履虫的运动、消化、排泄细胞器的观察
1．第一种方法 在载玻片上，滴一滴草履虫培养液，再加一滴质量分数为3％的甲基纤维素液，用大头针轻轻混匀，盖好盖片，虫体由于在较轴稠环境中，运动受到极大限制，速度明显减慢，在低倍镜下很容易找出运动最慢者，将它移至视野中央，转换高倍镜进行观察，会见到虫体呈倒草鞋形，口沟明显，周身纤毛缓缓摆动，胞咽内波动膜急速地运动，体内有大量的食物泡随着细胞质流动而流动。如果我们紧盯着虫体一端观察，就会见到放射状的收集管与位于其中间的伸缩泡交替扩张与收缩。用这种方法进行观察，最好在20 min之内完成，否则虫体会发生变形崩解，如未观察完，需重新制片。
在制片时，为了能显示出食物泡，可以在滴好的培养液中，用玻璃棒蘸少量质量分数为1％的洋红溶液与质量分数为0．１％的中性红溶液与之相混，静置3～5min，再加质量分数为3％的甲基纤维素液，这样制片后镜检就能见到大小不一呈红色的食物泡，在草履虫体内随细胞质的流动而流动。
2．第二种方法 在载片上，先将滴加的培养液与染液相混，将一根略长于载片宽度的头发，放在液滴右侧，垂直于载片长边方向放好，然后盖上盖玻片，使头发上下两端正好露在载片之外。取一小块吸水纸，沿着盖片有头发一侧的边缘吸水，吸到盖片下的水分大多被吸走而又没有出现失水空缺的现象为止。这时，用左手轻按着盖片，右手将头发轻轻拉出，这样载片与盖片通过剩余的极少量水而紧紧地贴在一起。在低倍镜下观察，就会看到放置头发的位置，有不少草履虫被阻遏在那里，并被盖片压成扁平状，找出其中运动最缓慢者，转换高倍镜继续观察。
（三）大核的观察
滴一滴培养液于载片上，加少许碘液与之相混，盖好盖片。在低倍镜下观察，就会发现被杀死的草履虫的身体中央，有一个大的肾形结构被染成深褐色，这就是草履虫的大核。
（四）草履虫接合生殖现象的观察
经研究，每一种草履虫内存在着不同的繁殖群，每一个繁殖群内又存在不同的接合型，只有同一个繁殖群内不同的接合型之间才能发生接合，进行接合生殖。过去那种将含有生长旺盛的草履虫的培养液，经离心去掉培养液，加自来水稀释，间隔一段时间观察接合生殖现象的方法，之所以有时观察到的接合生殖率过低，其主要原因在于它们大多数属于不同的繁殖群，不会发生接合，只有少数草履虫属于同一个繁殖群内的不同接合型，所以观察到的接合生殖现象甚少。为了避免上述接合生殖率过低的现象发生，就要把多处采来的草履虫，单独进行纯化培养，并编号，勿混。当草履虫旺盛的生长势头达到顶点，培养液开始出现变清透明的时候，表明虫体已饱食即要转入饥饿，这时可将各个培养液一一进行离心，然后将浓集的草履虫按照序号两两之间进行混合，放在20～250C环境下，每隔１h观察一次，如果发现某组虫体间发生接合，成对现象较多，就表明它们是属于同一繁殖群内的两个相对接合型。以后只要将这两个相对接合型虫体各自分开培养，不断提供充足饵料，并让它们保持旺盛生长，就可以随时取样相混合，草履虫会立即或在数小时之内发生接合生殖。
