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玩转观赏鱼玄丽八招之女娲造"鱼"解密 [复制链接]

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离线爱上兰寿
 
只看楼主 倒序阅读 使用道具 0楼 发表于: 2005-07-19
用显微注射法将绿色荧光蛋白基因导入金鱼受精卵中表达
  绿色荧光蛋白(GFP)是从水螅水母类动物中分离、纯化出来的一种荧光蛋白物质。这种蛋白质在体外只要经适当波长的光激发便可发出绿色荧光,其所发绿光用普通荧光显微镜就可检测到,因而具有检测灵敏度高和操作简便等优点。而且该蛋白对宿主细胞不存在毒性,检测GFP时也无损于细胞或胚胎的完整性和活力。因此,作为基因表达的真实报告者GFP,无疑是研究动物胚胎形成过程中基因表达动力学的理想材料。转基因技术的出现,使遗传工作者可有目的有预见地改变动物遗传性状,创造出更优良的新品种、新品系。1982年,美国科学家首次采用该技术将大鼠生长激素(GH)基因导入小鼠受精卵中获得了“超级鼠”,开创了利用基因转移技术培育动物新品系的新纪元。1984年,国内学者将人的生长激素基因导入鲫鱼受精卵中,培育出世界上第一批转基因鱼。从此,世界各国科学家们对转基因鱼做了大量工作,取得了很大进展。然而时至今日,转基因鱼的研究主要限于促进生长和提高抗性两个方面,其它如改变观赏鱼的体色、花纹等尚未见报道。本文在金鱼受精卵中导入GFP基因,目的是利用GFP基因的发光性,尝试改变金鱼体色,提高其观赏价值;同时将GFP作为报告基因,用来检测外源基因在金鱼体内的整合表达。
1 材料与方法
1.1 转基因材料 绿色荧光蛋白(GFP)基因购自Clontech公司,pUC118、EcoRI、SmaI和T4DNA连接酶等生物试剂购自华美生物工程公司;转基因Olypus显微注射仪购自基因公司;金鱼受精卵由湖南长沙市开福区观赏鱼基地提供。
1.2 GFP基因的重组构建 将pUC118和pGFP分别经EcoRI和SmaI双酶切后,回收pUC118酶切后的大片段及pGFP的小片段(GFPcDNA4.7kb)。将回收的片段先用苯酚抽提,再经等体积苯酚:氯仿纯化,两倍体积无水乙醇沉淀、干燥后,在T4DNA连接酶的作用下构建重组表达质粒GFP。
1.3 GFP基因导入 利用显微注射法,即在金鱼繁殖季节(4-5月),选择健康无损伤,性腺发育良好的亲鱼,用激素进行人工催产,然后在池中捞出刚产出的受精卵(1-2细胞期)置于培养皿中,进行显微注射。注射部位为受精卵动物极,注射量为2~5nL(106~107拷贝)。显微注射后的受精卵放在与对照组的温度、光照和水流等条件相同的孵化盆中孵化。
1.4GFP基因的表达检测 采用体视镜(15×,加470~510nm波长紫外光源)对显微注射过的金鱼受精卵进行胚胎发育跟踪观察,注意其荧光发生部位,记录、拍照,计算荧光表达率。表达率(%)=表达荧光的鱼苗数导入pGFP的总出苗数×1002
 结果与分析
2.1 GFP基因的重组构建 随机挑取重组菌落,提取质粒DNA,用EcoRI/SmalI进行酶切鉴定,结果在10个菌落中发现有2个重组子(C和I),证明GFP基因已插入CAP下游
2.2 GFP基因的导入  采用显微注射法,将重组构建好的GFP基因先后导入3批金鱼受精卵中,共12318粒,最后孵出鱼苗1091尾(表1)。结果发现,注射过GFP的受精卵发育良好,其胚胎发育与对照组比较,出膜时间推迟18~36h,这可能与注射操作对卵膜和卵内各种组织的机械损伤有关。加之实验期间水温变幅大,出苗率均较低。2.3 GFP基因的表达检测 在对导入了GFP基因的金鱼胚胎发育跟踪观察中,发现在胚胎早期检测不到GFP基因的表达产物,一直到肌肉效应期才能明确检测出来。在导入的12318粒金鱼受精卵中,出苗1091尾,其中有65尾得到了表达。在表达荧光的65尾鱼苗中,又有很多是属于嵌合体,其荧光主要分布在金鱼的头部、尾部或胸鳍、背鳍和尾鳍等处。例如在第1批显微注射GFP基因的金鱼受精卵中,23尾得到表达,但其中就有13尾为嵌合体,只有10尾为全身表达。其原因可能是:(1)显微注射GFP基因后,基因在受精卵中的整合具有随机性;一般认为外源DNA常常是在刚完成复制或正在进行复制的染色体区段整合;(2)显微注射操作时,由于注射GFP基因的部位(受精卵动物极)不同,GFP基因在组织间的分布呈嵌合状态,为不稳定的嵌合性整合,从而出现嵌合体;(3)只有当GFP基因整合到金鱼卵的基因组中时,才会出现全身荧光,得到全身表达。
3 讨论
3.1 转基因操作对胚胎成活率的影响 相对哺乳动物来说,鱼类受精卵显微注射后胚胎存活率要高。因为鱼类是体外受精和体外发育动物,显微注射后的胚胎不需要象哺乳动物那样操作(如移植给受体);另外,鱼类细胞质注射(鱼类细胞核很难定位)较细胞核注射对胚胎损伤小,存活率高,虽然其整合率较细胞核注射低。
3.2 基因的嵌合表达 显微注射法有两个重大缺点:需要昂贵的设备和因嵌合体比例太高致使总的转基因效率低下。至于怎样最大限度地避免嵌合型转基因鱼的出现,目前还尚无定论。报道,在罗非鱼受精卵发育到单细胞期注射外源基因,可避免嵌合型转基因鱼的出现;梁利群等认为外源基因导入受精卵的最佳时期应选在单细胞后期。结合我们的实验,考虑到鱼的受精卵发育很快,仅仅在单细胞末期注射的话,时间太短不利实验进行,因而建议:(1)显微注射时间可适当延至2细胞期;(2)受精卵在进行显微注射操作前,可置于低于室温(14~18°C)的条件下,以延缓其发育速度。
3.3 转基因的安全性 GFP作为一种效果很理想的选择标记,已在转基因动物研究中广泛应用,然而对于GFP基因对宿主动物是否具毒副作用,还是一个需要慎重回答的问题,尤其是当转基因表达水平过高时,其不仅可能会影响到宿主动物本身的健康,还可能会影响转基因产品的质量。另外,转GFP基因的鱼,一旦被释放到天然水域中,它会在多大程度上影响水体生态平衡;人若是食用了转GFP基因的鱼是否安全; 人们对这种“发绿光”转基因鱼持何种态度等等,我们都还不明确。因此,在将GFP基因用于转基因研究时,这些都是需要审慎考虑的问题。
只看该作者 1楼 发表于: 2005-07-25
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